ProImmune 是全球领先的荧光标记人和小鼠 CD1d 四聚体商业来源。 CD1d-脂质复合物与具有特定特异性的 NKT 细胞的 T 细胞受体结合（由所使用的脂质配体决定），允许通过流式细胞术鉴定和计数抗原特异性 CD1d 限制性 NKT 细胞。
我们的四聚体显示出出色的亮度和实验重现性。 为避免与溶解和加载最常用的配体 α-半乳糖基神经酰胺* (α-GalCer) 相关的困难，我们的四聚体已预先加载。 它们也可以空载供应，用于装载您选择的配体。
Engkilde, K. et al. (2010). “Prevention of diabetes in NOD mice by repeated exposures to a contact allergen inducing a sub-clinical dermatitis.” PLoS One. 11;5(5):e10591.[PubMedID:20485668]
Figure 1. 重复应用 PPD 可抑制 NOD 小鼠糖尿病的发展。 该图显示了四组小鼠的糖尿病发病率的 Kaplan-Meier 曲线。 DNCB-rep、PPD-rep 和水，是指每隔一周重复暴露于 DNCB、PPD 或水的小鼠组。 PPD-induc 是指在出生后第四周仅暴露于 PPD 的小鼠组。 反复暴露于 PPD 的 NOD 小鼠的累积糖尿病发病率为 47%，而水处理组为 93%（P=0.004）。 所有所示曲线的对数秩检验给出 P=0.008 的显着性。
自然杀伤 T (NKT) 细胞参与调节与多种疾病相关的免疫反应，似乎对免疫的几个方面至关重要。 它们代表了一种独特的淋巴细胞群，它们共同表达 NK 细胞标志物和半不变的 T 细胞受体。 当用 CD1d 限制性糖脂抗原刺激时，NKT 细胞会产生大量 Th1 型和/或 Th2 型细胞因子，导致树突细胞、NK 细胞、B 细胞和 T 细胞的下游活化。 NKT 细胞的功能障碍或缺陷已被证明会导致自身免疫性疾病（如糖尿病或动脉粥样硬化）和癌症的发展，并且它们也与人类哮喘的疾病进展有关。
CD1d 分子是非经典 MHC 分子，其特征是非多态性、物种间保守并具有窄、深、疏水的配体结合口袋。 这些结合口袋能够将糖脂和磷脂呈递给自然杀伤 T (NKT) 细胞。 NKT 细胞代表了一种独特的淋巴细胞群，它们共同表达 NK 细胞标志物和半不变 T 细胞受体 (TCR)。 它们参与调节与多种疾病相关的免疫反应。
表征最好的 CD1d 配体是 α-半乳糖基神经酰胺 (α-GalCer)，最初来源于海绵提取物。 CD1d 分子呈递 α-GalCer 导致 NKT 细胞识别并快速产生大量 IFN-γ 和 IL-4，从而赋予 α-GalCer 治疗功效。 最近，溶酶体鞘脂异球三己糖基神经酰胺 (iGb3) 已被确定为 CD1d 配体。 这种内源性鞘脂被认为是 NKT 细胞发育的原因。
ProImmune 的荧光人类 CD1d 阴性对照四聚体仅模拟装载载体（未装载配体），不会与 NKT 细胞结合。 将此阴性对照试剂与装载 CD1d 四聚体的配体结合使用将允许准确量化低频阳性群体。 注意：阴性对照 CD1d 四聚体不能加载配体。
Figure 2. 1 X 106 PBMC 与 1 个测试 (0.5 µl) APC 标记的、加载 α-GalCer 的人 CD1d 四聚体（左图）或 1 个测试（0.5 µl）APC 标记的阴性对照人 CD1d 四聚体（右图）一起孵育 30 分钟 在 4°C。 洗涤步骤后，将细胞与总体积为 50 µl 的抗 CD3 FITC 和抗 CD19 PE 在 4°C 下孵育 20 分钟。 在进一步洗涤两次后，获得细胞并通过流式细胞术进行分析。 在绘制 CD1d 四聚体与 CD3 之前，通过对 CD19 阴性细胞进行门控，从图中消除了非特异性染色。
ProImmune 的人类 CD1d 四聚体也被证明可以对恒河猴的 PBMC 染色——参见客户案例研究的数据
哈佛医学院（美国）的 Markus Skold 博士和 Sam Behar 博士用来自缺乏 B 细胞的幼稚 B6 小鼠的脾细胞测试了 ProImmune 的小鼠 CD1d R-PE 标记的四聚体。 四聚体空着使用或加载了 α-GalCer*。 细胞还用抗 CD4-Alexa488 和抗 CD3-PerCP 单克隆抗体染色，并对活的 CD3 阳性细胞进行门控。
Figure 3. 为了减少背景染色，脾耗尽了 B 细胞用 CD19 微珠（Miltenyi Biotec）。程序上用了 3 X 105 细胞在每一个染色。细胞孵育跟 2.4G2 单克隆抗体在 25µg/ml 在 50µl 的样本，在 4°C， 15 分钟为了拦住 Fc 受体。然后一次冲洗，细胞就孵育和一个测试量（2µl）地1小鼠 CD1d 四聚体 30 分钟。接下来，细胞孵育在 4°C， 20 分钟和抗 CD4-Alexa488 和抗 CD3PerCP 单克隆抗体在 50µl 总容积。最后两次冲洗，细胞被获得之后用流式细胞化验检测。
Nur, H. et al. (2013). “Preclinical Evaluation of Invariant Natural Killer T Cells in the 5T33 Multiple Myeloma Model” PLoS ONE 2013 8(5): e65075.
Figure 4. 来自幼稚和 5T33MM 小鼠的血液、BM、脾脏和肝脏的鼠 iNKT 细胞的代表性 FACS 分析。 活细胞（7-AAD 阴性）用 a-GalCer/CD1d 四聚体染色，该四聚体与不变 TCR 的 Va14 和 TCR-b 特异性结合。 双阳性 iNKT 细胞被门控。 百分比显示在每个图中。
文章由 Prof. Derek G. Doherty, 爱尔兰都柏林三一学院医学院免疫学学科
大多数 T 淋巴细胞被认为对主要组织相容性复合体 (MHC) 分子呈递的蛋白质抗原的肽片段表现出特异性。 然而，许多研究表明 T 细胞对 MHC 样抗原呈递分子 CD1 呈递的脂质和糖脂抗原具有反应性。 它们包括微生物的脂质成分以及自身抗原，其中许多是响应细胞应激或感染而产生的，因此，检测脂质反应性 T 细胞对于了解疾病病理和免疫可能很重要。 事实上，许多研究强调了不变自然杀伤 T (iNKT) 细胞在预防感染、癌症和自身免疫疾病方面的重要性，使用 iNKT 细胞的细胞疗法在癌症患者的临床试验中显示出前景。
iNKT 细胞识别由 CD1d 呈递的脂质，CD1d 是已知将抗原呈递给 T 细胞的四种人类 CD1 同种型之一。 它们已被广泛研究，因为它们可以使用异种糖脂、α-半乳糖苷神经酰胺 (α-GalCer) 轻松激活，并使用对其不变 T 细胞受体 (TCR) α 链（人类中的 Vα24Jα18）特异的抗体进行检测。 我们最近表明，食道腺癌 (OAC) 患者的循环 iNKT 细胞已耗尽，可能会预防该疾病。 但现在很明显，人类有许多其他 CD1d 限制性 T 细胞，称为 2 型 NKT 细胞，它们使用非不变 TCR 识别其他脂质。 此外，小鼠研究提供的证据表明 2 型 NKT 细胞可以调节肿瘤免疫。
为了检查 OAC 患者中 2 型 NKT 细胞的存在，我和我的博士生 Ashanty Melo 使用 ProImmune 装载各种糖脂的 CD1d 四聚体，使用流式细胞术检测 CD1d 限制性 T 细胞。 最初，我们使用 α-GalCer 优化了糖脂加载，并测试了加载的四聚体是否可以检测到扩增的 iNKT 细胞系。 我们在四聚体中加入 12 摩尔过量的涡旋、加热和超声处理的 α-GalCer，在含有 Tween-20 或皂苷的 PBS 中稀释至 0.2 mg/mL，在室温下放置 18 小时，发现 0.25 µL 的原始四聚体就足够了 使用流式细胞术检测 iNKT 细胞（图 5）。 重要的是，由 ProImmune 提供的相同数量的阴性对照四聚体没有染色任何细胞（未显示）。
Figure 5. 使用载有 α-GalCer 的 CD1d 四聚体检测 iNKT 细胞。 左图显示了流式细胞仪点图，显示了扩增的人 iNKT 细胞表达的 CD3 和 Vα24/α18 TCR。 右侧图显示了使用 0.025、0.1 和 0.25μl 加载 α-GalCer 的 CD1d 四聚体检测相同细胞的情况。
我们接下来尝试使用已知或预测与 CD1d 结合并激活 T 细胞的其他糖脂重复这些实验。 然而，优化更加困难，因为我们没有已知表达脂质/CD1d 复合物特异性 TCR 的细胞系。 我们使用来自健康供体的外周血单核细胞 (PBMC)，并且由于已知一些 Vδ1 亚型的 γδ T 细胞可以识别 CD1d 呈递的糖脂，我们还用扩增的 Vδ1 T 细胞系测试了我们的负载四聚体。 重要的是，0.25 µL 的 CD1d 四聚体（优化用于检测 iNKT 细胞的量）未能检测到 2 型 NKT 细胞。 我们发现 1µL 的 CD1d 四聚体装载有相似摩尔比的硫苷脂、溶血硫苷脂、心磷脂或四肉豆蔻酰心磷脂在 PBMC 和/或 Vδ1 T 细胞系中检测到 T 细胞，而类似数量的阴性对照四聚体或空四聚体则没有（Figure 6）。
Figure 6. 使用载有糖脂的 CD1d 四聚体检测 2 型 NKT 细胞。 PBMC（上图）或分选和扩增的人 Vδ1 T 细胞（下图）用抗 CD3 抗体和 1ul CD1d 四聚体染色，卸载或加载指定的糖脂。 然后通过流式细胞术计数四聚体阳性细胞。 FMO，荧光减一对照染色无四聚体。
我们接下来列举了来自 OAC 患者和健康对照受试者血液中的上述 2 型 NKT 细胞群，发现对硫苷脂和四肉豆蔻酰心磷脂具有反应性的 T 细胞在 OAC 患者中的数量明显更多，在这些患者中，它们的比例高达 10% 总 T 细胞和高达 80% 的 Vδ1 T 细胞。 在 OAC 患者中鉴定出新型 2 型 NKT 细胞后，我们能够表征它们对呈递糖脂的 CD1d 阳性细胞的功能反应，并发现了它们抑制 iNKT 细胞抗肿瘤反应的证据。 因此，CD1d 四聚体可用于识别可能影响对癌症和传染性病原体的免疫力的新型 T 细胞群。
